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多肽溶解中的主要问题是二级结构的形成。
虽然疏水肽链二级结构的形成更明显，但除了最短的肽链外，该现象发生在几乎所有肽链，与极性无关。因此，溶解多肽的第一个原则是用无菌的蒸馏水或去离子水（如果条件允许则用无氧水）。
多肽溶液可能遇到细菌降解。为避免该现象的发生，多肽应溶解在无菌的蒸馏水中，或者用0.45或0.2µm孔径的滤膜过滤除菌。
包含Cys、Met、Trp的多肽特别容易氧化，因此应该溶于无氧的水中。无氧水可以通过注入惰性气体（氮、氦、氩）减压除气得到。
若多肽不溶于纯水，超声处理有助于打碎颗粒并增加溶解度。注意：超声处理会引起溶液发热和多肽降解。
若多肽中包含多个碱性氨基酸，使用1~10%的乙酸水溶液；对于疏水性非常强的多肽，则使用50%乙酸。
若多肽中含有大量酸性氨基酸，可用1~10%氨溶液或乙酸乙基吗啡或重碳酸盐等挥发性的碱性缓冲液溶解。pH值在层析前必须调整。
异丙醇和乙腈能溶解中等大小的肽。若肽要上柱，有机溶剂的量则必须很少，否则将严重影响滞留时间。
若多肽因为含有Val、Leu、Met、Phe、Tyr、Ala等芳烃侧链而高度疏水，或为中性肽时，DMF或DMSO等膜变性剂的使用，有助于多肽的溶解。
a. 高浓度膜变性剂通过破坏多肽的二级结构而助溶。
b. 膜变性剂适于多肽分析液的制备，但可能会对其生物活性的研究工作造成干扰。
c. DMF是最佳变性剂（最高浓度可达30%），滴加至多肽溶解。
d. 反相层析时，DMF将与洗脱液前峰一起流出，依进样量的多少，峰值可能很高。大多数肽能在大量DMF流出后几分钟内流出，若肽链很小，洗脱太早，多肽的量将降低。
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